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视网膜色素变性（RP）和Leber先天性黑蒙症（LCA）是遗传性退行性视网膜营养不良，视力下降最终导致失明。已显示一些基因参与了早期视网膜病的营养不良，包括CRB1和RPE65。最近，具有RPE65基因变异的年轻RP患者可以使用基因疗法。当前的研究程序在模仿患者疾病的各种疾病模型上测试腺相关病毒基因的扩增或编辑治疗载体。这些包括几种动物和新兴的人类衍生模型，例如人类诱导的多能干细胞（hiPSC）衍生的视网膜类器官或hiPSC衍生的视网膜色素上皮（RPE），以及人类供体视网膜外植体。CRB1基因的变异是青春期之前患有视力障碍的患者早期发作的常染色体隐性RP的主要原因，以及新生儿生命初期几个月内出现严重视力障碍的LCA的主要原因。这些患者尚不能从可用的基因治疗中受益。在这篇综述中，我们将讨论不同CRB1人和动物视网膜变性模型的最新进展，优点和缺点。此外，我们将描述已开发的新型治疗工具，这些工具可潜在地用于CRB1基因变异的RP患者的视网膜基因增强治疗。
CRB家庭成员
面包屑（Crbs）是一种大的跨膜蛋白，最初在果蝇上皮细胞的顶膜发现（Tepass等，）。几年后，发现果蝇果蝇蛋白质残渣的人类同源物中的突变，称为CRB1（Crumbs同源物1），参与了人类的视网膜营养不良（DenHollander等人，）。人类CRB1基因定位在1q31.3染色体上，迄今包含12个外显子，具有12种已识别的转录物变体，3个CRB家族成员和超过kb的基因组DNA（DenHollander等，）1。像果蝇的同系物一样，规范的CRB1是一种大型跨膜蛋白，在其细胞外N端由多个表皮生长因子（EGF）和层粘连蛋白球状结构域组成（图1A）。细胞内C端结构域包含FERM和保守的谷氨酸-精氨酸-亮氨酸-异亮氨酸（ERLI）PDZ结合动机。最近描述了CRB1的另一种转录物CRB1-B，并建议其具有与典型CRB1显着的细胞外结构域重叠，同时带有独特的5和3结构域（Ray等，）。在哺乳动物中，CRB1与CRB2和CRB3一起是Crumbs家族的成员（图1A）。CRB2显示出与CRB1几乎相同的蛋白质结构，除了耗尽了四个EGF域。CRB3A缺乏完整的典型细胞外结构域，但包含跨膜结构域，该跨膜结构域与具有FERM结合基序和ERLIPDZ序列的细胞内部分并列。由于最后一个外显子的可变剪接，第二个蛋白（同种型CRB3B）来自相同的CRB3基因，导致具有半胱氨酸-亮氨酸-脯氨酸-异亮氨酸（CLPI）氨基酸序列的C末端不同，因此缺少PDZ领域（Fanetal。，;Margolis，）。有趣的是，CRB3B亚型在哺乳动物中发现，但在斑马鱼或果蝇中却没有发现（Fan等人，）。有关CRB同工型的更多详细信息，请参见Quinn等。（）。
图1.CRB亚细胞定位和拟议的运输机制的示意图。（A）全长CRB1（CRB1-A），CRB1-B，CRB2，CRB3A和CRB3B蛋白的示意图。（B）CRB1，CRB2和CRB3A在小鼠，验尸后的人类供体，猕猴，hiPSC和人类胎儿视网膜中的亚细胞定位。（C）果蝇中的贩运机制建议在物种间保留，改编自Aguilar-Aragon等。（）。
视网膜中的CRB定位
在哺乳动物组织中，CRB1和CRB2主要在视网膜中表达，然而，在其他组织中，例如在肾脏足细胞，大脑的脑室下区域和脊髓中也发现了CRB2表达（Ebarasi等人，;Slavotinek等人，；Dudok等人，；Tait等人，）。CRB蛋白位于视网膜内，位于感光细胞和Müller神经胶质细胞（MGC），多个感光细胞（PRC）或多个MGC之间的粘附连接上方的根尖下区域（SAR）（Pellikka等，；vandePavert等，）。此外，与CRB1不同，CRB2也位于视网膜色素上皮（RPE）中。定义亚细胞定位对于了解CRB蛋白的功能至关重要（图1B）。小鼠研究表明，全长Crb1蛋白仅存在于SAR的MGC中，而Crb2和Crb3存在于PRC和MGC中（vanRossum等，）。视网膜的连续切向冷冻切片，然后进行蛋白质印迹，显示了在小鼠PRCS外部片段中Crb1-B转录物的表达（Ray等人，年）。死后人类视网膜中的第一批超微结构数据显示了不同的定位，其中CRB2位于SAR的MGC和感光器内部节段的囊泡中，而CRB1位于SAR的MGC和PRC中（Pellissier等，b，）。在SAR的MGC的微绒毛中以及在中国的内部区域发现了CRB3A（Pellissier等，b，）。然而，最近发现，CRB1和CRB2位于人胎儿视网膜中期和人iPSC衍生的视网膜类器官的SAR的MGC和PRC中，而在孕早期仅检测到CRB2（Quinn等人）。。，a）。人类胎儿视网膜和RPE的单细胞RNA测序数据证实，CRB1存在于视网膜祖细胞和MGC中，但不存在于RPE中，这与小鼠对灵长类动物的定位研究一致（Hu等人，）。此外，在恒河猴和食蟹猕猴中也检测到了CRB1，CRB2和CRB3A的类似定位（Quinn等人，b）。在恒河猴和食蟹猕猴的内视网膜和RPE中也检测到CRB3A（Quinn等人，b）。这些最新数据表明，在人类中，CRB2也可能存在于中华人民共和国的SAR膜中，而不是仅存在于感光器内部节段的囊泡中。在死后人类视网膜与猴子，胎儿和视网膜类器官中观察到的SAR中CRB2模式的差异可以通过研究供体的年龄，样品的质量（在死亡后48小时内处理）或技术问题来解释。我们可以推测，CRB2在人类老年视网膜中的位置可能不同，在SAR处可能未检测到CRB2，或者在供体死亡后可能已从PRC质膜内吞了CRB2。使用新鲜的人类视网膜定义CRB1和CRB2的亚细胞定位的其他实验可能会解决这些差异。总之，根据所有这些证据，我们假设在灵长类动物（包括人）中，CRB1和CRB2位于SAR的两种细胞类型中。因此，MGC和PRC都应以预防RP患者的视网膜变性为目标。
最近，对Crb转运到果蝇上皮中正确的根尖位置进行了进一步研究（图1C;Li等，;Pocha等，;Kraut和Knust，;Aguilar-Aragon等，）。通过沿极化微管和F-肌动蛋白丝的电机驱动转运，Crb被含Rab11的内体正确定位。有趣的是，一旦微管负端导向蛋白动力蛋白丧失，含有Crb的Rab11内体就被基础转运而不是顶端转运（Aguilar-Aragon等，）。一旦将Crb成功定位到顶端膜上，就使用胞囊介导的递送将其以正确的定位递送到质膜上。sec15或sec5（囊泡亚基）的突变克隆强烈破坏了Crb的根尖定位，证实了将Crb转运到根尖膜时囊泡的基本需求（Aguilar-Aragon等，）。在培养的哺乳动物细胞中，囊泡与粘附连接和PAR3结合（Ahmed和Macara，年;Polgar和Fogelgren，年）。由于下面提到的哺乳动物中CRB，PAR6和PAR3之间的已知相互作用，因此这种贩运模型在物种之间可能是保守的。需要进一步的研究来测试上皮极化的机制在人类中是否保守。
哺乳动物组织中的CRB蛋白功能
各种研究表明，CRB1和CRB2是顶极极性因子，而顶基细胞极性对于上皮组织的形成和功能至关重要（Bazellières等，）。由于其独特的5和3结构域，需要更多的研究来定义最近描述的CRB1-B同工型的功能。下面，我们将描述CRB在维持细胞黏附和形态发生中的典型功能，及其在细胞分裂和发育中的作用。
维持细胞黏附和形态发生
CRB蛋白的原型ERLI序列对于与关键衔接蛋白相互作用至关重要。CRB核心复合物是由CRB和与LinSeven1（PALS1）相关的蛋白相互作用而形成的，Pin1称为膜相关鸟苷酸激酶p55亚家族成员5（MPP5），其中PALS1与CRB的保守C端PDZ域结合（Roh等人，;vandePavert等人，;Margolis，）。小鼠RPE中Mpp5的消融引起视网膜早变性，而神经视网膜中Mpp5的消融则没有，这表明PALS1在RPE的紧密连接处起着至关重要的作用，但在神经视网膜中却不起作用（Parketal。，）。核心CRB复合物在进化上是保守的，可调节顶端基极极性并维持细胞粘附（Bulgakova和Knust，）。Pals1可以与小鼠视网膜SAR处的Mpp3和Mpp4相互作用（图2A；Kantardzhieva等，，；Dudok等，）。在视网膜上特异性消融了Mpp3的Mpp3条件敲除（cKO）小鼠显示出局限性定位和Pals1水平降低，表明Mpp3对于维持外限制膜附近SAR的Pals1水平至关重要（Dudok等人，）。
图2.CRB交互伙伴的示意图。（A–D）拟议的相互作用伙伴和参与细胞粘附和形态发生的哺乳动物中形成的CRB复合物。（E）果蝇中拟议的相互作用伙伴建议在物种间保存。（F）参与细胞增殖的拟议相互作用伙伴。
此外，PALS1和CRB的结合可导致PATJ或多个PDZ域蛋白1（MUPP1）募集到根膜上（图2B；Roh等，）。PATJ连接并稳定人肠细胞中紧密连接的顶部和侧面成分（Michel等，）。在某些细胞中，MUPP1和PATJ复合物共存，并且MUPP1调节PALS1/PATJ极性复合物的细胞水平（Assémat等，）。免疫共沉淀研究表明，Mupp1在小鼠视网膜中与Crb1和Pals1相互作用，但与Patj相互作用不大（vandePavert等，）。PATJ优先结合PALS1并分配缺陷6同源物（PAR6；图2B；Adachi等，；Assémat等，）。PAR6是与哺乳动物细胞中CRB的ERLIPDZ结构域相互作用的关键衔接蛋白（Hurd等，；Lemmers等，）。PAR6导致PAR3，非典型蛋白激酶C（αPKC）和细胞分裂控制物42（CDC42）的募集，称为PAR复合物（Joberty等，；Lin等，；Suzuki等，;Yamanaka等，；Hurd等，；Whitney等，；Pichaud，）。PAR6-CDC42复合物是根尖基极极性和细胞粘附所必需的（Yamanaka等，）。
或者，已经描述了CRB-PALS1-EPB4.1L5复合物在哺乳动物中的重要性（Laprise等，，；Gosens等，）。共表达和共定位研究表明，在几个上皮来源的组织中，Ebb4.与至少一种Crumbs同源物和PALS1相互作用（图2C）。此外，在成年视网膜中，Ebb4.在外边界膜（OLM）上与CRB1和PALS1发生实质性重叠（Gosens等，）。Epb4.在极化MDCK细胞中的过表达影响细胞连接的紧密性，并导致紧密连接标记ZO-1和PATJ紊乱（Gosens等，）。然而，另一组发现，与斑马鱼和果蝇直向同源物不同，在没有Ebb4.的情况下，小鼠面包屑蛋白正常定位（Lee等人，）。应该进行进一步的研究以定义其在哺乳动物细胞中的精确分子机制。
备选的同工型CRB3B包含一个独特的羧基末端基序，即CLPI基序，表明上皮细胞中的结合伴侣不同。CRB3在上皮细胞中广泛表达。Crb3KO小鼠在上皮形态发生方面表现出广泛的缺陷，小鼠出生后不久死于囊性肾脏和整个肺中的肺蛋白碎片（Whiteman等人，）。有趣的是，在Ezrin基因敲除小鼠中也观察到了这些缺陷，这与在小鼠和哺乳动物细胞中检测到的CRB3B和Ezrin之间的相互作用相一致（图2D;Whiteman等人，;Tilston-Lünel等人，）。这表明CRB3B对上皮形态发生也至关重要，并在将顶膜与潜在的细胞骨架连接中发挥作用（Whiteman等人，;Gao等人，;Tilston-Lünel等人，）。因此，两个CRB3变体在小鼠肺中的作用仍有待确定。
果蝇Crb还被发现可以抑制磷酸肌醇3激酶（PI-3K）和Rac1的正反馈回路，从而抑制Rac1和PI-3K的激活并维持适当的根尖区域和上皮组织完整性（图2E）;Chartieretal。，）。此过程可能在不同物种中得以保留，但是，需要更多的哺乳动物细胞研究来支持这一假设。
CRB在细胞增殖中的功能
在果蝇和非洲爪蟾的MGC中，是相关蛋白1（YAP）在受损的视网膜中起重要作用（Hamon等人，，;Rueda等人，）。YAP是Hippo通路的核心成员，它调控着几个生物学过程，包括细胞增殖和存活（Yu等人，）。果蝇Crb的胞内结构域与Expanded相互作用，从而调节Hippo途径激酶的活性（Yu和Guan，；Yu等，）。在哺乳动物的肺上皮和乳腺癌细胞中，CRB3表达也与Hippo通路相关（Szymaniak等，；Mao等，）。更具体地说，CRB3通过与Kibra和/或FRMD6相互作用来影响Hippo途径（FRMD6是果蝇扩展的同系物；图2F）。由于CRB3表达水平低，河马途径被灭活，YAP不被磷酸化，并可以移动到表达YAP目标基因的细胞核中，从而导致细胞增殖增加和凋亡减少（Mao等人，）。同样在Crb1rd8与野生型小鼠视网膜中，几个Hippo信号转导相关基因被差异表达（Hamon等人，）。此外，CRB1和CRB2缺失也导致发育中的鼠视网膜中的YAP信号失调（Pellissier等，）。这些数据表明河马途径在控制细胞增殖中的重要作用。
视网膜疾病中的CRB1和CRB2
CRB1基因中的突变与广泛的视网膜营养不良有关，例如视网膜色素变性（RP）和Leber先天性黑蒙症（LCA）。RP是一种临床和遗传异质性疾病，在全球范围内影响着超过万人，患者通常会出现夜盲症，然后逐渐进行视野丧失，最终导致生命早期或中期完全丧失视力（Talib等人，年;Verbakel等人，）。RP患者的症状发作年龄为0至47岁，中位发病年龄为4岁（Talib等，）。约3–9％的常染色体隐性RP非综合征病例是由CRB1基因突变引起的（Vallespin等，；Bujakowska等，；Corton等，）。LCA是一种更严重的视网膜营养不良，导致新生儿严重的视力障碍或失明（DenHollander等，）。CRB1基因的突变约占所有LCA病例的7-17％（DenHollander等，；Vallespin等，；Bujakowska等，；Corton等，）。沿着CRB1基因描述了多种不同的突变，导致视网膜营养不良，而与RP或LCA没有明确的基因型-表型相关性，CRB1患者可能表现出独特的临床特征，例如色素性静脉曲张性视网膜视网膜萎缩，仅黄斑萎缩，与视网膜相关的视网膜变性大衣样渗出性血管病，RPE的小动脉旁保留或纳米眼病（Henderson等，;Bujakowska等，;Corton等，）。即使在具有相同纯合突变的患者队列中，疾病发作和严重程度的临床变异性也支持以下假设：CRB1突变患者的表型受其他因素调控（Mathijssen等人，）。到目前为止，对于CRB1基因突变的患者，尚无治疗选择。为了研究CRB1相关的视网膜营养不良的治疗选择，已经使用了几种模型。下文描述了与CRB1相关的人类和动物来源的视网膜模型。
直到最近，还没有任何RP患者描述CRB2基因突变。然而，Chen等。（）使用全外显子组测序（WES）发现了一个呈现RP的中国近亲家庭的纯合CRB2p.RG突变。该突变干扰CRB2蛋白的稳定性，从而诱导RPE变性，损害RPE吞噬作用并加速RPE凋亡。然而，仅描述了具有这种突变的有限数量的患者，在更多的RP患者中鉴定CRB2突变可更好地支持其致病性。
人类衍生的视网膜模型
使用人类诱导的多能干细胞（hiPSC）模型进行研究是一种在体外探索患者表型的新兴策略。这些技术允许访问以前有限或无法访问的材料，并且已在全球许多眼科实验室中进行了探索。常用的方法是将hiPSC分化为视网膜类器官。自第一个研究组以来，许多研究小组已经改编或创建了自己的方法，以更有效地生成层状良好的视网膜类器官（Meyer等，;Nakano等，;Zhong等，;Luo等，;Ovando-Roche等人，）。然而，经常报道跨hiPSC品系的分化效率差异很大（Capowski等，;Cora等，;Mellough等，;Chichagova等，）。Chichagova等。（）已经表明，三种不同的hiPSC细胞系响应IGF1或BMP4激活而分化为视网膜类器官的能力是依赖于细胞系和方法的。Hallam等。（）区分了五个hiPSC品系，其效率存在差异，但是通过区分5个月，所有视网膜类器官都能产生光反应，并包含格式良好的ONL，PRC包含内部部分，纤毛和外部类似部分。Luo等人尝试降低这种广泛的可变性。（）描述了使用Wnt信号通路拮抗剂Dickkopf相关蛋白1（DKK-1）在所有六个hiPSC系中有效产生视网膜类器官。视网膜类器官的大分子RNA测序分析表明，体外分化在细胞分化标志物，视网膜疾病基因和mRNA选择性剪接的时间表达中概括了体内视网膜发生（Kim等人，）。这些结果使视网膜类器官尽管具有很高的可变性，但在包括药物发现，研究视网膜变性机理，开发基于细胞的治疗策略等在内的广泛应用中引起了人们的极大兴趣。
在健康的hiPSC衍生的视网膜类器官中，已经确定了CRB复合成员的定位和表达起点。早在分化第28天（DD28）时，就在外界膜上发现了CRB复合体的几个成员CRB2，PALS1，PATJ和MUPP1，只有在DD之后才发现CRB1的典型且清晰的点状染色模式。在DD视网膜类器官中仍可检测到所有CRB复合物成员以及粘附连接标记p-catenin和N-cadherin（Quinn等人，a）。CRB1和CRB2蛋白表达的发作概括了在人胎儿视网膜中观察到的表达，在CRB1表达之前CRB2表达明显发作（Quinn等，a）。
包含纯合错义突变（c.TC）或杂合错义突变（c.GT和c.AG或c.GA和c.TC）的三个CRB1患者hiPSC品系成功分化为视网膜类器官，并在DD处进行分析。在这里，所有三个视网膜层被开发出来：以Tuj1阳性树突为标志的视网膜神经节细胞层，以SOX9阳性视网膜祖细胞为标志的神经母细胞层，以及以restorein阳性PRCs为标志的外核层。但是，经常在外限膜上方发现异位恢复素阳性细胞，所有错义的CRB1类器官系都发育得很小，但频繁地破坏了OLM中CRB复杂成员的定位，这在对照系中没有发现（Quinn等人，a）。来自这些CRB1患者hiPSC视网膜类器官的数据表明，视网膜退化表型与先前在缺乏CRB1的小鼠，表达CWCRB1变体的小鼠或缺乏CRB2的小鼠视网膜中发现的相似（vandePavert等人，，a；Alves等人。，）。不久的另一项研究描述了在CRB1基因（c.AG和c.GA）中携带复合杂合突变的hiPSC成功分化为视网膜类器官的现象。分化35天后，所有三个胚层和视网膜祖细胞表达的标志物（包括N-钙粘着蛋白，视紫红质和PAX6）均存在，但本文未描述表型（Zhang等人，）。据我们所知，只有这两篇论文报道了CRB1患者hiPSC衍生的视网膜类器官的产生。在这三种CRB1患者系中观察到的可再现表型（Quinn等，a）为评估潜在的基因治疗方法提供了一个很好的模型。
眼科领域另一种常用的方法是将hiPSC分化为RPE单层。已经建立了使用生长因子混合物将hiPSC区分为RPE单层的有效方案（Zahabi等，;Buchholz等，;Shutova等，）。然而，目前正在尝试使用非生物产品，例如小分子，其将限制移植时感染或免疫排斥的风险。Maruotti等。（年）开发了一种协议，该协议使用趋化蛋白（CTM）与先前已知的神经诱导剂烟酰胺（NIC）结合，以有效地将hiPSC区分为RPE单层。在三个独立的hiPSC细胞系中，RPE分化是有效的，并且强烈表达了关键的RPE标记，例如小眼科相关转录因子（MITF），PMEL17和紧密连接蛋白小带闭塞蛋白1（ZO-1）。当在培养物中放置更长的时间以使其成熟时，也强烈表达Bestrophin1（BEST1）和65kDa的RPE特异性蛋白（RPE65）（Maruottietal。，）。使用稍微修改的协议，史密斯等。（）将另外六个hiPSC系分化为hiPSC-RPE单层，所有六个也表达了关键的RPE标记ZO-1，BEST-1和MITF。另一项研究通过RNA测序数据揭示，hiPSC-RPE与胎儿RPE样品分组在一起，表明它们的基因表达高度相关且相似（Smith等人，）。此外，Zahabi等。（年）提供了概念证明，可以将包括两个RP线在内的多个视网膜疾病特异性hiPSC线分为RPE单层。总而言之，该数据说明了hiPSC-RPE作为具有RPE突变的视网膜疾病的模型系统的潜力。与CRB相关，最近的研究表明，在人类RPE分化为视网膜类器官的过程中，CRB2在人RPE中表达（Quinn等人，a）。此外，还有一些RP患者在RPE细胞中表达了特定的CRB2变异（Chenetal。，）。因此，产生hiPSC-RPE的方法可用于探索CRB2有特定变异的患者的治疗可能性。
CRB1相关的动物视网膜变性模型
许多研究小组专注于动物模型，以获取，理解和开发可能用于治疗RP和LCA患者的视网膜变性的基因治疗策略。多年来，已开发出多种模拟患者CRB1相关表型的动物模型。这些模型的变化范围从轻度到重度，从早到晚，以及MGC或光感受器特异性表型。视网膜双基因敲除CRB1和CRB2，有助于了解这两种CRB蛋白对视网膜疾病病因的影响，并解释了在Crb1变体小鼠模型中观察到的相对温和的表型（Mehalow等人，；vandePavert）等，，a，b）。
LCA类鼠标模型
已经报道了四种显示CRB1LCA样表型的小鼠模型：Crb1KOCrb2ΔRPC，其中视网膜祖细胞中的Crb1和Crb2均被消融（Pellissier等人，），其次是Crb1KOCrb2ΔimPRC，其中MGC中的Crb1被消融，而Crbmm2中的Crb2被消融。在MGC和祖细胞中具有剩余Crb2水平的PRCs（Quinn等人，），第三是Crb1KO/WTCrb2ΔRPC小鼠模型，其MGC中Crb1的水平降低，视网膜祖细胞中的Crb2消融（Pellissier等，），最后是Mrb中的Crb1和Crb2都被切除的Crb1KOCrb2ΔMGC（Quinnetal。，b）。所有这四个模型都表现出视力下降，这是由视网膜电图（ERG）响应降低所指示。另外，通过外部限制膜破坏，异常的视网膜层合，ONL和INL的核混合以及视网膜细胞的异位定位观察到视网膜变性。这些小鼠模型显示了一种早期发作表型，其严重性由上述顺序指示。简而言之，在最严重的小鼠模型Crb1KOCrb2ΔRPC中，最早在胚胎第13天（E13）就发现了该表型发作，这在整个视网膜上都可以观察到（Pellissieretal。，）。在整个视网膜的E15处检测到Crb1KOCrb2ΔimPRC的视网膜变性，但在成年小鼠中，上视网膜比下视网膜受到的影响更大（Quinn等人，）。同样在Crb1KO/WTCrb2ΔRPC小鼠中，在E15处检测到视网膜变性，但主要影响周围视网膜（Pellissier等，）。最后，Crb1KOCrb2ΔMGC小鼠在E17处出现了最初的变性迹象，那里的大部分外周视网膜受到了影响。之前已经描述并总结了这些模型之间更细微的差异（Quinnetal。，b）。这些数据表明，所有四个Crb1小鼠模型均模拟患者的LCA表型，因此可用于将来的治疗方法开发。
RP鼠标模型
到目前为止，已经描述了十二种类似CRB1RP的小鼠模型，包括（1）Crb1基因错义变异的Crb1KO/CW（vandePavert等，a），（2）Crb2ΔMGC，其中MGC中仅消减了Crb2（Alvesetal。，），（3）Crb1rd8小鼠在Crb1基因中具有自然无义突变（Mehalowetal。，），（4）Crb1KO，全长Crb1蛋白从视网膜radial骨切除胶质祖细胞，MGC和身体的其余部分（vandePavert等，），（5）从感光细胞和MGC中消除了Crb1-B的Crb1-B（Ray等，），（6）Crb1null，其中第7a内含子外显子5a缺失会破坏所有Crb1亚型（Ray等，），（7）Crb2Δ杆，其中Crb2仅在发达的杆状PRC中被消融（Alves等，），（8）Crb1KOCrb2Δ棒，其中Mrb中的Crb1被消融，PRCs中的Crb2被消融（Alves等，），（9）Crb1KOCrb2low–imPRC，缺少Crb1，未成熟的感光细胞中Crb2的含量降低（Quinn等人）（），（10）视网膜祖细胞中没有Crb1和Crb2水平降低的Crb1KOCrb2Δlow-RPC（Pellissier等人，b），（11）Crb2ΔRPC，其中Crb2在视网膜祖细胞中被消融了（Alves等。（），最后，（12）Crb2ΔimPRC在未成熟的PRC中伴有Crb2消融（Alves等，）。不同的Cre小鼠模型显示出镶嵌变化（与野生型细胞相邻的突变），但是十二个Crb模型中的十一个显示在外部限制膜处破坏，其中行或单个感光核突出到视网膜下空间或进入外部丛状层，变性的视网膜表型（表1）。
表1.视网膜色素变性（RP）小鼠模型示意图。
Crb1rd8小鼠在Crb1基因的外显子9中具有自然发生的单碱基缺失，导致移码和过早终止密码子，从而截断了Crb1的跨膜和胞质结构域。这导致光感受器变性，主要在视网膜下象限中观察到，这是由视网膜褶皱和假红斑引起的（Mehalow等，）。在Crb1KO小鼠模型中，主要保持视网膜层合，并在视网膜下颞象限发现变性。变性通过单个或成组的PRCs伸入视网膜下间隙，玫瑰花结形成和新血管形成来指示。在0万只小鼠中，通过视网膜电图检查未发现视网膜整体功能丧失，这表明视网膜的大部分不受Crb1丧失的影响（vandePavert等，，b）。曝光实验表明，曝光不会引发而是会加剧视网膜变性（vandePavert等，b）。在这些Crb1小鼠模型中观察到的轻度表型表明Crb2蛋白可能补偿了CRB1缺失的影响。
在Crb1del–B中，PRCS取消了替代的Crb1-B同工型，而Crb1null破坏了所有潜在的Crb1同工型（Ray等，）。Crb1del–B小鼠在OLM中没有显示出明显的破坏，而Crb1null小鼠中的破坏与Crb1rd8相当（Ray等，）。尽管Ray等人未提及。（），Crb1KO小鼠也表现出明显的OLM破坏，这很大程度上取决于遗传背景以及光线的暴露（vandePavert等，，b）。由于IrCaptureSeq提示Crb1-B是小鼠和人类视网膜中最丰富的转录本，因此进行了Crb1null与Crb1del–B小鼠的杂交，以定义Crb1-B在视网膜中的相关性。这种杂合的Crb1null/del-B与纯合的Crb1null小鼠表现出相似的OLM破坏（Ray等，）。因此，在Crb1rd8，Crb1null，Crb1null/del-B和Crb1KO小鼠中发现了类似的OLM破坏。必须对影响Crb1-B的小鼠模型进行视网膜功能测量，以了解其功能并将其与先前描述的Crb1小鼠模型进行比较。此外，迄今为止，最严重的视网膜表型来自Crb1小鼠，同时伴有Crb2的丢失。Crb2ΔRPC和Crb2ΔimPRC都分别在胚胎第18.5天（E18.5）和E15.5处显示视网膜早变性，这种差异是由于Cre重组酶的不同表达模式和时机所致，形态表型导致暗视点的差异以及ERG的明视条件已经达到1M的年龄（Alves等，，）。有趣的是，与Crb2ΔRPC小鼠相反，Müller神经胶质细胞，神经节细胞和无长突细胞的层合在Crb2ΔimPRC小鼠中也放错了位置。在Crb1KO/WTCrb2ΔRPC小鼠中也观察到了这些层压缺陷（Pellissier等，）。
另一个小鼠模型Crb2Δrods显示出仅限于上视网膜的轻度和晚期发作表型（Alves等，）。在约3M和所有6M的Crb2Δ杆小鼠中，观察到外层限制膜的破坏，周围上视网膜的感光层变薄以及PRCs伸入视网膜下腔。在9M只老年小鼠中观察到ERG暗视a波的减少，而在视动头部追踪反应（OKT）空间频率或对比敏感度方面没有观察到差异。有趣的是，虽然大多数中华人民共和国受到影响，但其余所有中华人民共和国都显示出成熟的内部和外部细分市场。其余的杆起作用，并且视锥显示正常形态。MGC中Crb1的同时缺失增强了该表型（Alves等，）。与Crb2Δrods小鼠相比，这些小鼠Crb1KOCrb2Δrods显示出相似但增强的表型。在此，在3M处观察到ERG暗视a波的减少，并在6M起开始更加明显。此外，从3M年龄开始发现OKT对比敏感度显着降低（Alves等，）。在所有这些小鼠模型之间，表型发作的差异可以通过视网膜形成过程中Cre表达的发作以及细胞类型的特异性消融来解释。从较晚的时间点消融Crb2导致较温和的表型。有趣的是，当Mrbs中的Crb2被消融时，Crb2ΔMGC观察到非常轻度的形态表型，未观察到使用ERG测得的功能性后果（Alves等人，），但MGC的Crb1和Crb2均被消融导致了严重的LCA表型（Quinn等，b）。该数据表明，Crb2在MGC中具有多余的功能，而在PRCs中，它对于适当的视网膜层压和功能至关重要。
有趣的是，Crb1KO表型位于颞下象限，而Crb2Δrods表型主要在周围视网膜和中央视网膜上观察到。这些差异可能与下视网膜中较高的Crb2水平有关，而上视网膜中较高的Crb1表达水平（Pellissier等，b）。另外，可能存在修饰因子，其在视网膜的上部或下部富集，引起不同的表型。
除了这些小鼠模型外，还发现了Crb1外显子6具有自发突变的大鼠，其模仿了人类2型黄斑毛细血管扩张（Zhao等人，）。常染色体隐性插入缺失突变导致3周龄大鼠的早期发作表型，ERG反应大大降低。这些大鼠表现出局灶性视网膜层合丧失，OLM破坏以及PRC，MGC和RPE改变（Zhao等人，）。此模型与Crb1小鼠模型之间的差异可能是由于不同类型的突变或这些不同动物物种表现出的不同遗传设置导致的。
CRB1视网膜营养不良的基因增强策略
视网膜营养不良的基因增强策略引起了人们的兴趣。最近，对于RPE65基因具有双等位基因突变的RP和LCA青年患者，基因治疗变得可行。Voretigeneneparvovec-rzyl或它的商业名称：LUXTURNATM使用腺相关病毒载体血清型2（AAV2）通过视网膜下注射将RPE65基因的功能性拷贝传递到RPE细胞中。RPE65转基因表达导致RPE65蛋白在RPE细胞中产生并正确定位，从而补偿这些患者的蛋白损失并恢复了视觉周期（Maguire等人，）。如今，正在进行大量的临床研究，探索将AAV用作视网膜疾病的治疗载体，例如RP，与年龄相关的湿性黄斑营养不良（AMD），LCA等（Wang等，）。但是，到目前为止，尚无针对CRB1基因突变的RP和LCA患者的治疗选择。在下文中，我们将描述新颖的治疗工具，这些工具有望在RP患者中用于CRB1视网膜基因增强治疗。
目前，AAVs是治疗视网膜营养不良的主要基因传递平台。主要研究AAV的原因在于它们的低毒性，转导分裂细胞和非分裂细胞的能力，它们不整合到宿主基因组中以及AAV衣壳变体表现出明显的细胞向性。Wang等人最近对基本的AAV生物学，AAV载体学以及当前的治疗策略和临床进展进行了全面概述。（）和BuckandWijnholds（）。AAV的主要缺点是包装能力有限，大于4.5kb的基因表达盒无法容纳在单个AAV中。因此，AAV介导的CRB1基因治疗的发展也具有挑战性。全长巨细胞病毒（CMV）普遍存在的启动子和CRB1cDNA超出了AAV包装的限制。但是，使用工程改造的最小CMV启动子和密码子优化的CRB1cDNA，可以在小鼠的MGC中充分表达全长CRB1蛋白（Pellissier等，a）。使用该AAV-CMVmin-hCRB1在小鼠中进行的临床前研究表明，CRB1的表达在CRB1小鼠模型中有害，而在野生型小鼠中则无害（Pellissier等，）。此外，还有更多可能被靶向的CRB1转录物变体（Quinn等人，）。有趣的是，使用密码子优化的结构和功能家族成员CRB2抢救CRB1相关的视网膜病变的替代策略在Crb1小鼠模型中恢复了视网膜的功能和结构（Pellissier等，）。在那项研究中，CRB2交付后检测到改善的感光层形态和ERG反应。AAV9与全长CMV启动子的组合被用于靶向感光体和MGC，而当感光体或MGC均被CRB2靶向时未观察到挽救（Pellissier等，）。此外，几个小组探索了通过双重或三重AAV方法克服限制的AAV包装容量的可能性（Trapani等，;Carvalho等，;Maddalena等，）或通过增加包装容量（DingandGradinaru，）。然而，迄今为止进行的研究表明，与单一AAV载体相比，双重AAV方法的表达水平较低（Trapani等，;Carvalho等，）。
几个研究小组专注于AAV介导的基因传递，以定义hiPSC衍生的视网膜类器官和/或RPE中的向性。Garita-Hernandez等人在用CAG启动子和GFP包装的四个不同的AAV衣壳中（AAV2，AAV2-7m8，AAV8，AAV9）。（年）显示第44天感染AAV2-7m8最有效地转导了来自hiPSC的视网膜和RPE类器官。发现了AAV9的有限转导（Garita-Hernandez等，）。另一项研究表明，与AAV9相比，使用AAV-CMV-GFP构建体在DD处更有效的视网膜类器官转导，特别是在具有AAV5或ShH10YF衣壳的MGC中。最近，Lane等人。（）证明了使用与CAG启动子包装在一起的AAV5在DD视网膜类器官中有效的PRCS转导。此外，通过用人RP2进行AAV5介导的基因增强，能够通过防止ONL变薄和恢复视紫红质的表达来挽救RP2KO视网膜类器官中发现的变性（Lane等，）。因此，在视网膜类器官中测试CRB1或CRB2表达载体将有助于发现CRB基因疗法治疗患者的CRB1相关性视网膜营养不良。
另外，有不同的非病毒介导的基因治疗方法。一个例子是纳米颗粒的使用。最近审查了三种代表性的纳米粒子，即金属基，聚合物基和脂质基纳米粒子，描述了它们的特性以及在眼科治疗中的最新应用（Wang等人，）。不久，最广泛表征的纳米颗粒是基于聚合物的CK30-PEG纳米颗粒，其中包含用聚乙二醇取代的赖氨酸30-聚体压实的质粒DNA（Fink等，；Han等，）。从理论上讲，这些方法具有无限的基因包装能力，这对于诸如CRB1的大型基因显示出很大的优势。这些纳米颗粒还能够感染RPE和PRC，并且可以在小鼠中以与AAV相当的规模和寿命驱动基因表达（Cai等，；Han等，）。CK30-PEG纳米颗粒具有可耐受的安全性，对小鼠和非人灵长类动物的眼睛无毒（Ding等，;Akelley等，）。据我们所知，到目前为止，尚无成功的临床研究描述使用这些纳米颗粒。需要更多的研究来定义这些纳米颗粒在视网膜基因治疗中的临床意义。进一步的临床前研究和临床试验将有助于发现患者CRB1相关性视网膜营养不良的新基因治疗方法。一项回顾性CRB1自然史研究（NHS）已发表（Talib等人，），其前瞻性NHS以及评估新临床治疗措施治疗CRB1视网膜营养不良症疗效的策略的策略将在报告中报道。到年底。最近，一家名为HORAMA的法国生物技术公司与莱顿大学医学中心签署了针对CRB1基因突变的独家许可协议，以治疗遗传性视网膜营养不良。根据目前的时间表，HORAMA希望在年与该候选药物一起开展I/II期临床研究（HORAMA，年）。
结论
在这篇综述中，我们讨论了（1）哺乳动物细胞中CRB蛋白的功能，（2）CRB1人和动物视网膜变性模型的最新进展和潜在工具，以及（3）描述了可用于视网膜基因增强治疗的治疗工具用于CRB1基因突变的RP和LCA患者。
作者贡献
NB，JW和LP有助于撰写，审阅和编辑手稿。NB写了原始草案。所有作者都为这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
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