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李红义
北京八零同创畜牧科技有限公司
想下一代拥有最好遗传基因，最直接的方法就是做胚胎移植，胚胎来源有两种，一种是体内胚，一种是体外胚。本报告主要介绍体外胚胎生产（invitroproduction,IVP）的相关内容。
一、IVP的好处是什么?
国际胚胎技术协会（IETS）收集的最新数据显示，全球范围内的流行和使用方式已从传统方法转向使用新颖的体外技术生产胚胎。IVP作为生殖工具的一些主要优点：
1
保存最好的遗传基因
遗传优良的动物可以重复用作卵子供体，将产生的胚胎转移到价值较低的动物中，从而产生具有高经济价值的后代。如果有价值的动物意外死亡/宰杀，可以从卵巢中提取卵母细胞，然后将所得胚胎转移到受体中。
2
世代间隔更短
通常，供体卵母细胞可在两周的周期内被抽吸，而大多数胚胎移植（ET）程序在60天的周期内运行。这允许增加优质牲畜的繁殖。
3
克服繁殖障碍问题
IVF可用于从传统方法中不能生产的优良动物中繁殖出后代。原因可能是生殖道异常或受损，对刺激的反应不良或特发性原因。
4
较少的激素依赖
越来越多的证据支持不再使用昂贵的超排卵药物，因为成熟可以在体外成功进行。因此，由于这些激素，供体动物没有暴露于任何潜在有害的副作用。
二、IVP如何实现?
过去，IVP的技术在国际上垄断的，但是技术的进步使IVP成为一种日益可行和负担得起的解决方案。
1.层流罩：为精子、卵子和胚胎发育提供一个稳定、无毒和无病原体的适宜的体外生存环境
2.孵化器：通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，如稳定的温度（38.5°C）、稳定的CO2水平（5%）、恒定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（95%），来对细胞/组织进行体外培养
3.离心机：对精子进行离心，选出活力最强的精子与受精
4.体视显微镜：随时在实验室观察卵母细胞及胚胎生长，胚胎的冷冻保存和复苏
三、影响IVP实验室主要因素
1
实验室建设
实验室建设一般要求：远离放射源、远离污染源，通风，在高处等。相关指标有：VOCs（一般指挥发性有机物，VolatileOrganicCompounds），大家最熟悉的就是甲醛，对胚胎发育十分有害。解决方法一个是用层流来隔离，第二个来说质量较好的实验室材料，减少有害物质的散发；尘埃粒子，检测层流空气的洁净程度，一般用粒子计数器或者菌落培养来观测；压差及风速。通常情况下，要通过控制
压力，保证空气只能从里往外流，外边污染空气不能进入实验室。
实验室不同位置的风速
这里特别要注意一下距地面1米的风速，所有的设备都在这个高度，如果此处风速过于大的话，会对实验室个各方面都产生影响，比如胚胎培养液在台面上，如果风速过大，挥发速度会过快，或者培养液打开之后，培养箱里面的气体搅混速度太快了，对胚胎就会有影响。
2
培养液
培养液提供卵子从受精到囊胚的全部供给，是胚胎发育最重要的保证，但是培养液也是最不稳定的一个因素。
上图是整个IVP生产的整个过程，从囊胚细胞收集，到体外成熟、体外受精、体外培养，还有移植和冷冻，整个过程都在体外进行。体外受精时间比较长，整个过程大约需要九天，这九天的时间胚胎都在培养液之中，所以这个过程对培养液得要求特别高。同时，每个步骤所需要得培养液并不完全想相同，而且每一种液体的成分比较复杂，有十几种或者几十种无机盐或者是蛋白、氨基酸，还有生长因子等。这个IVP是一个环环相扣得复杂过程，任何一个步骤有一点差错，可能导致最终颗粒无收。
体内体外胚胎的发育区别
上图可以看出体外（InVitro，右）和体内（InVivo，左）是不一样的。体内的圆圈代表一个卵，卵外面一层黑色条状物体是透明带，，在体内生殖道可以为它提供营养成分和氧气，卵母细胞把所有废弃东西都从生殖道排出来，营养粒子和二氧化碳可以正常进出。然而，在体外，卵母细胞跟培养液没有互相交流，卵母细胞直接放到培养液里面，培养液的温度、PH和渗透压都会对胚胎产生影响。
温度：在减数分裂过程中，如果培养液温度过高或者过低，都会对细胞有影响。减数分裂纺锤体破坏对卵子受精的影响：受精失败、异常受精、胚胎发育潜能降低。（Wangetal.,;Massaroetal.,;Zengetal.,.,Laneetal.,)。
PH值的变化：一般来说培养液设计会在5%到6%的二氧化碳环境中，PH值保持在7.35±0.05是最适合胚胎生长的环境。
培养液放入培养箱中PH值的变化
上图可以看出培养液放入培养箱中，需要很长的时间后PH值要才达到正常的稳定值，需要很长时间，所以一般来说我们生产胚胎的时候，需要至少在培养箱中放置4个小时。
培养液拿出培养箱PH值变化
上图可以看出，培养液拿出培养箱后PH值变化非常快，在没有缓冲系统的情况下，大约45秒PH值就开始变化，3分钟之后的PH值是一个关键点，所以在体外受精操作没有缓冲系统的情况下，3分钟之内必须要结束。牛精子分别放入PH值（4.5-7.5）停留0、5和10分钟，观察不游动的精子数，结果显示导致精子不游动的原因是PH值而不是时间。所以PH值对于整个实验过程十分重要和关键。
渗透压：大多数物种的生殖道的渗透压都很高，鼠-mOsl/L、人-mOsl/L、牛-mOsl/L、大鼠mOsl/L，人们尝试在体外用如此高的渗透压培养胚胎均失败，目前体外培养液渗透压在-mOsl/L之间。胚胎会改变体积以调节通过胚胎膜的渗透压力，因为渗透压来回变化的过程中，会对胚胎细胞膜会形成一个渗透压打击，透压会导致细胞骨架不可逆的损伤，从而导致基因表达和基因印记改变，因此，体外操作时液体覆盖石蜡油是一个很好的选择。
3
设备耗材
设备方面，主要做质量控制，具体记录内容和质控频率见下表:
4
经验丰富的胚胎学家
胚胎学家相当于实验员，他需要有理论知识，有细胞生物学、发育生物学和低温生物学的知识，还有一定的理论知识能力，能够校准，最好懂一些简单的维修。
四、胚胎冷冻
胚胎冷冻有玻璃化冷冻和程序化冷冻两种方法。
上图是程序化冷冻仪，整体较大，并与一个液氮灌相连，能够精确控制冷却温度，但冷冻时间特别长。优点是解冻较快，且方便。
上图玻璃化冷冻仪，玻璃化冷冻仪非常简单，直接把胚胎放到冷冻机制当中，投入液氮中。玻璃化冷冻，比较方便，但是解冻比较复杂，需要一个专业的实验室。但是这两个冷冻方法如果在最理想的条件下，最好的实验室，最好的胚胎学家操作的情况下，玻璃化冷冻的效果要比程序化冷冻要好。
错过最佳冷冻时期的胚胎
一般情况下，牛胚胎冷冻在囊胚早期刚开始扩张的时候，上图胚胎已经扩张，错过了最佳冷冻时期，冷冻过程中容易形成结晶，结晶大了之后可以刺破细胞膜，降低胚胎存活率。当遇到这种情况时，可以用激光剖膜仪，把胚胎的自备层打破，让里边的液体跑出来，减少里面的液体含量，增加冷冻效果。
专家简介
李红义
北京八零同创畜牧科技有限公司实验室主任，京津冀胚胎学会委员。毕业于内蒙古大学，从事胚胎行业20年，主要从事体外胚胎生产，胚胎冷冻，卵母细胞冷冻等工作。
本文内容根据李红义在中国农垦乳业联盟成员大会中的报告内容整理
编辑整理：韩萌
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