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发表期刊：JClinInvest
影响因子：IF=11.57
伯豪公司提供的产品或服务:HumancircRNA芯片
尿病视网膜病变(DR)是处于工作年龄的成年人失明的主要原因。其中，血管周细胞变性是主要的临床表现。然而，控制周细胞变性的机制却不明确。环状RNA(CircularRNAs,circRNAs)已被发现在多种生物过程和疾病进展中起重要作用。本研究中，作者研究了circRNA在周细胞生物学和糖尿病视网膜血管中的作用。研究发现，糖尿病患者外周血细胞中cZNF表达上调；在糖尿病小鼠模型的视网膜血管中和糖尿病患者的玻璃体中，cZNF表达也同样上调。进一步分析其功能发现，cZNF沉默会导致周细胞的存活率，增殖和和分化能力降低。在体外实验中，cZNF还可以抑制周细胞向内皮细胞的募集。cZNF可以作为miR-29a-3p海绵并诱导NG2，LOXL2,CDK2的表达来调控周细胞生物学功能。下调cZNF或过表达miR-29a-3p加重链脲霉素诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍。相反，过表达cZNF或抑制miR-29a-3p可改善糖尿病玻璃体诱导的视网膜周细胞变性和血管功能障碍。总的来说，该研究证实了circRNA在DR中介导的周细胞生物学的机。诱导cZNF或拮抗miR-29a-3p可能成为将来治疗DR的新方法。
结果
1.在周细胞中，高糖可以显著上调环状RNAcZNF的表达
通过circRNA芯片检测高糖处理和正常对照的周细胞的circRNA表达，共筛选到显著差异表达的circRNAs，其中包含个上调的circRNAs和个下调的circRNAs。通过qPCR进一步验证top5上调和top5下调的circRNAs发现，circ_是上调最多的circRNA。该circRNA是由ZNF转录而来的。Sanger测序确定其在周细胞中为组成型表达。该circRNA可以抵御Rnase酶的消化。并且发现该circRNA主要在周细胞的细胞质中表达，预示着其可能会作为ceRNA，来参与周细胞的生物学调控。动物实验和细胞实验同样证实了cZNF在高糖诱导下会显著上调。为了进一步确认cZNF的调控机制，作者运用TRANSFACdatabase进行上游转录因子的预测，结果显示，其有多个转录因子结合位点，其中包括与糖尿病的发病相关的转录因子SP1.
2.体外实验证实cZNF可以调节周细胞功能
周细胞是多能的干细胞和/或祖细胞，可以分化为多种不同的细胞类型。cZNFsiRNA1沉默cZNF降低了周细胞标记物的表达，包括血小板衍生生长因子受体(PDGFR)-细胞增殖、血清-sma、Desmin和NG2(图2A)。周细胞-内皮细胞的corsstalk对血管稳态的稳定至关重要。而且内皮细胞屏障的正常功能需要周细胞募集。基质共培养检测显示，cZNF沉默降低了HRVECs周细胞募集(图2B)。与对照组相比，周细胞cZNF沉默增加了大分子的通透性。然后作者确定异常的周细胞分化和募集是否与改变细胞活力或增殖有关。MTT和Ki67染色显示，沉默cZNF降低了周细胞的活力和增殖能力。流式细胞术检测细胞周期结果显示，与野生型对照组相比，沉默cZNF周细胞S期细胞减少3倍，g1期细胞增加约30%。PI染色和caspase3/7活性检测显示，沉默cZNF可加重高糖或氧化应激诱导的细胞凋亡，表现为caspase3/7活性增加，PI阳性细胞增多。
3.cZNF在体内调节视网膜周细胞功能和血管完整性
单独沉默cZNF(cZNFshRNA)或单独糖尿病(DR)可在2个月、4个月和6个月时降低视网膜周细胞的覆盖。合并cZNF沉默和糖尿病进一步降低了视网膜周细胞的覆盖。结果表明，cZNF沉默和糖尿病协同调节周细胞的覆盖。采用Evans蓝法检测视网膜血管渗漏。在1个月、2个月、4个月和6个月时，作者发现实验因素cZNF沉默和糖尿病协同加重糖尿病引起的视网膜血管渗漏，这与cZNF调整周细胞覆盖的结果相似。
4.cZNF在体外作为miR-29a-3p的海绵调节周细胞功能
由于cZNF主要表达在周细胞的细胞质中，作者推测cZNF在转录后水平上作为miRNA海绵调控周细胞功能。作者通过TargetScan算法，寻找Cznf所能吸附的miRNA。荧光素酶活性筛选显示，miR-29a-3p、miR-和miR-模拟转染降低荧光素酶活性LUC-cZNF。FISH检测显示，cZNF和miR-29a-3p在周细胞细胞质中重叠共表达。进一步采用荧光素酶活性测定法研究cZNF能否与miR-29a-3p结合。过表达cZNF或anti-miR-29a-3p逆转了mir-29a-3p介导的对荧光素酶活性的抑制。而不能产生cZNF的cZNF载体由于cZNF产量低或循环效率低，影响较小。此外，作者还发现，转染miR-29a-3pinhibitor或mimic并没有改变周细胞中cZNF和ZNFmRNA的表达。这些结果表明，cZNF只是作为miR-29a-3p的海绵，通过将miR-29a-3p从其靶基因中隔离出来，从而降低miR-29a-3p的活性。
5.cZNF-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2网络调节周细胞功能和血管完整性
然后作者在体内研究了miR-29a-3p在视网膜血管功能障碍中的作用。miR-29a-3pagomir或cZNF沉默导致NG2和CDK2表达增加。miR-29a-3pagomir可模拟沉默cZNF对视网膜血管功能障碍的影响。在糖尿病视网膜中，注射miR-29a-3pagomir降低了周细胞的覆盖，加重了血管渗漏(图6C和6D)，增加了微动脉瘤、脱细胞毛细血管和周细胞影。
结论
该研究证实了circRNA在DR中介导的周细胞生物学的机制，诱导cZNF或拮抗miR-29a-3p可能成为将来治疗DR的新方法。
参考文献
Jiang,Q.,etal.,CircularRNA-ZNFregulatesdiabetes-inducedretinalpericytedegenerationandvasculardysfunction.JClinInvest,.
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