基于iPSC来源视网膜类器官模型,AAV

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年2月14日/医麦客新闻eMedClubNews/--美国食品药品监督管理局（FDA）于年批准了眼科基因治疗药物Luxturna，用于治疗具有RPE65基因突变的Leber先天性黑蒙症（LCA）患者。尽管被誉为罕见病基因治疗的重大进步，但是该疗法不适用于其它形式的LCA。由CRX常染色体显性突变是LCA的主要形式，但这种突变也很难用基因疗法进行治疗。

除RPE65基因突变的LCA外，其他LCA目前尚无治疗方法。可用的动物模型不能完全捕获人类疾病的复杂性，从而减慢了进一步临床转化的速度。

来自美国国立眼科研究所（NEI）的科学家团队，采用患者诱导多能干细胞（iPSCs）构建了显性CRX-LCA的视网膜类器官模型，并利用该模型证明了使用腺相关病毒（AAV）载体递送CRX作为基因增强策略的可行性。该研究报告近日发表在StemCellReport期刊上。

这项研究为开发治疗显性CRX-LCA和其他CRX视网膜病变的基因疗法提供了概念验证。

显性CRX-LCA对于基因治疗的挑战

视杆细胞同源异形框基因（CRX）能够编码一种与DNA结合的蛋白质（也称为CRX），并指示视网膜的感光细胞（photoreceptor）产生光敏色素，称为视蛋白（opsin）。没有功能性的CRX蛋白，感光细胞将失去检测光的能力并最终死亡。

常染色体显性CRX-LCA之所以很难用基因疗法治疗，是因为添加更多的正常基因并不总是能使视网膜恢复功能。常染色体显性突变的患者仍然具有CRX的一个正常拷贝，但是突变的蛋白会对正常蛋白产生干扰。有时，仅仅添加更多的正常蛋白质不仅可能无法恢复视网膜正常功能，还可能以难以预测的方式导致疾病加重。

▲图片来源：Cell

类器官模型的建立

动物模型能够表型化人类CRX视网膜病变，并提供治疗的概念证明，但依然无法考虑到人类视网膜的发育、细胞类型组成和分子特征。

为此，利用来自两名LCA患者及其未患LCA的家庭成员的诱导多能干细胞，开发了视网膜类器官。从皮肤细胞开始，分多个阶段构建了复杂的视网膜样组织，并诱导了成熟的感光细胞和其他视网膜细胞的产生，并具有各自的遗传特征。

此外，研究还发现患者来源类器官产生的感光视蛋白远少于对照组（即来自未患LCA的家庭成员的类器官），证明了光感受细胞的分子表型受到干扰，这与临床观察到的光反应消失相符。

▲图片来源：Cell

AAV载体递送CRX修正基因

利用开发的视网膜模型，研究人员验证了一种针对常染色体显性LCA的基因增强策略。

这项研究中，研究小组重新设计了CRX启动子，旨在更精确控制受体感光细胞表达CRX基因的数量，启动子是控制基因表达时间和方式的DNA相邻序列。研究人员将CRX修正基因及其工程启动子包封在AAV中，然后将其递送到类器官感光细胞中。

▲图片来源：Cell

研究结果显示，这一基因增强策略恢复了两个患者来源类器官的部分CRX蛋白功能，促进了视蛋白在视杆细胞和视锥细胞（两种感光细胞）中表达。

该研究的第一作者兼NEI神经生物学、神经退行性变和修复实验室主任AnandSwaroop博士说：“这一策略对两种CRX突变都有效，是令人欣喜的结果。这也表明，这一基因增强策略对于常染色体显性突变LCA具有治疗潜力。”

该研究的共同作者、NEI临床主任BrianBrooks博士表示：“这项概念验证的基因疗法研究是治疗不同形式LCA的第一步，也是转化科学的一个很好的例子。”

总而言之，这项研究使用视网膜类器官，作为验证疾病机制、和开发显性CRX-LCA基因增强疗法的平台。研究也显示出，其基因增强策略对于视网膜和中枢神经系统其他部位的罕见、显性遗传性疾病具有治疗潜力。