7分糖尿病视网膜病变的单细胞转录组分析

文章名：Akimba小鼠视网膜的单细胞转录组分析揭示了糖尿病视网膜病变病理生物学中细胞类型的特异性

发表期刊：Diabetologia

影响因子：7.

发表时间：Jul0

拟解决问题：糖尿病视网膜病变是糖尿病的常见并发症，也是导致视力损害和失明的主要原因。尽管经常有相关报道，但人们对其病理生理学的理解仍然不完整。本研究的目的是通过系统地绘制退化的糖尿病小鼠视网膜不同细胞类型的转录变化，为糖尿病视网膜病变的分子和细胞变化的复杂网络提供更深入的了解。

实验设计

6个造模小鼠+2个野生小鼠的视网膜样本

实验方法用造模能复现临床糖尿病视网膜病变的特征的Akimb小鼠进行实验，对12周大的野生型(C57Bl/6J)和Akimba(Ins2AkitaVegfa+/)小鼠的视网膜组织进行单细胞RNA测序，共获得个视网膜细胞的转录组数据，这些数据可以被注释为8种不同的视网膜细胞类型。利用STRING分析，我们研究了神经细胞、胶质细胞和免疫细胞间差异表达的基因网络，从而对发生在Akimba视网膜的病理变化有一个全面的认识。通过亚聚类分析，我们进一步描述了大胶质细胞和炎症细胞亚群。使用免疫组织化学、westernblotting和ELISA在蛋白水平上证实了显著的结果。研究背景

糖尿病性视网膜病变是糖尿病常见的微血管并发症，是导致失明的主要原因。根据微血管退行性变和缺血性损伤的程度，分期为非增生性糖尿病视网膜病变或晚期增生性糖尿病视网膜病变。糖尿病视网膜病变的进展伴随着越来越多的血管异常，包括微动脉瘤、出血、毛细血管阻塞、血液视网膜屏障功能障碍、血管基底膜增厚和新生血管形成。这些并发症可能导致糖尿病黄斑水肿，其特征是血管渗漏和伴发黄斑肿胀，是糖尿病视网膜病变患者最常见的致盲原因。糖尿病视网膜病变由神经退行性病变和神经炎症性病变组成，其中胶质、神经元和内皮功能障碍相互依赖，是疾病发展的关键因素。然而，在这些单个细胞间隔中发生了哪些变化以及它们是如何相互作用的，仍有很多未知。单细胞RNA测序(scRNAseq)技术的出现为以单细胞分辨率解剖视网膜等复杂生物系统提供了机会。

主要结果

该研究确定了糖尿病视网膜病变Akimba小鼠模型中炎症、代谢和氧化应激介导的变化的分子途径，并区分了炎症细胞和大胶质细胞的不同功能亚型。

结果说明

（1）单细胞RNA测序分析得出15个cluster对应8种视网膜细胞类型。图1a-f展示了Akimba小鼠糖尿病性视网膜病变的特征。共分析了个细胞，每个细胞平均检测到个基因和个UMI。其中，个细胞(61%)来自Akimba视网膜，76个细胞(9%)来自野生型视网膜。在野生型和Akimba样本中分别检测到和个基因。

图1

（2）Akimba和野生型视网膜分离的个细胞的tSNE图，显示15个cluster以及对应的8个细胞类别以及两组样本的细胞分布。图e展示的是两类小鼠视网膜样本不同细胞类型的相对丰度，Akimba视网膜中的杆状光感受器减少，导致其他视网膜细胞类型比例较高。

（）Akimba与野生型大胶质细胞差异表达基因网络的STRING分析，a图展示的是上调基因之间的网络关系b图展示的是下调基因之间的网络关系。Akimba差异基因表达分析与野生型星形细胞差异表达基因的基础上,发现了以下功能网络在Akimba调节星形细胞:核糖体,细胞骨架,免疫系统流程,S蛋白,谷胱甘肽代谢,铁离子体内平衡、细胞周期调控、细胞凋亡和OXPHOS。值得注意的是几个反应性胶质增生的标记物，包括Gfap、Lcn2、Serpinan、Serping1和C4b。Akimba大胶质细胞中下调的基因与糖酵解、中枢神经系统(CNS)发育和OXPHOS相关。尽管在两个数据集中都观察到了OXPHOS相关的转录本，但Akimba小鼠中这些转录本上调的数据最为显著。

（4）大胶质细胞的亚类（即使用鉴定为大胶质细胞重新聚类并鉴定，以期找到更多的多样性细胞类型）。RhoGTPase信号和S蛋白(亚簇0)；抗原递呈(I类MHC)、免疫系统和内质网(subclass1)；代谢和核糖体蛋白((subclass2)和细胞外基质(ECM)沉积、胶原、(离子)转运蛋白、谷胱甘肽代谢和特异性生长因子信号通路，如IGF结合蛋白(IGFBPs)和TGF小分子/骨形态发生蛋白(BMP)信号((subclass4)。值得注意的是，除了大胶质细胞外，subclass4中还发现了一小部分表达视网膜色素上皮(RPE)标记的细胞。

（5）为了更好地观察其多样性，免疫细胞进一步聚类。根据每个亚群特异性最强的基因，确定了三个免疫细胞亚群：(1)Ccr2low非炎性单核细胞，(2)静息和激活的小胶质细胞，()炎性单核细胞来源的巨噬细胞。后者是Akimba小鼠视网膜中所特有的细胞类型。

（6）为了证实从scRNAseq分析中观察到的结果，在蛋白水平上验证了几个关键标记的表达。免疫组化证实了位于大胶质细胞的12周大Akimba视网膜中S蛋白和GFAP的增加。通过观察到增加isolectin-B4+信号(即小胶质细胞激活和炎症细胞涌入)在Akimba视网膜，确认激活免疫反应。经过细胞类型特异的基因表达差异分析,发现转录本的增加与金属离子和氧化应激反应有关。因此，通过westernblot和免疫组织化学来检测MT和HO-1的表达。

（7）研究者们发现Akimba视网膜中MT和HO-1蛋白的显著增加，在细胞过程的上调，它们主要定位于视网膜外部和内部的神经元上。用ELISA评估糖酵解酶GAPDH在6、8、10和12周龄野生型和Akimba小鼠视网膜裂解物上的明显代谢转换。在所有时间点，Akimba小鼠的视网膜GAPDH蛋白水平显著降低。

总结

通过单细胞RNA测序，人们对糖尿病视网膜病变Akimba模型中神经元、胶质细胞和炎症细胞的转录特征和多样性有了更深入的了解。主要发现总结为如下几点:

(1)视网膜主要是杆状光感受器和特异性炎症细胞群丰度发生变化，;

(2)大胶质细胞的代谢和功能改变，可能影响其支持功能;

()免疫系统通路的激活、氧化还原和金属离子失衡;

(4)大胶质细胞表型的异质性，包括不同的促纤维化和促炎群体。

以上的发现支持了大胶质细胞在视网膜神经退行性疾病中起关键作用的新观点。但也存在一些不足，该结果还应该在其他早期/中期糖尿病视网膜病变模型中进行实验研究，为了确认它们与人类的相关性，也应该在患者样本中得到证实。此外，还需要在功能实验中评估差异表达通路，以评估它们在糖尿病视网膜病变中是否发挥有害或保护作用。

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参考文献

VanHoveInge,DeGroefLies,BoeckxBrametal.Single-celltranscriptomeanalysisoftheAkimbamouseretinarevealscell-type-specificinsightsintothepathobiologyofdiabeticretinopathy.[J].Diabetologia,.